復雜注射劑之脂質體的表征與解決方案

脂質體粒徑控制的重要性

納米脂質體 (nanoliposomes) 是一種具有類細胞膜磷脂雙分子層的納米囊泡體，因為磷脂層與細胞膜的結構類似，可以與細胞膜融合，從而將藥物送入細胞核中。脂質體載體的釋藥機制，使其不但可以增加藥物溶解度，還具有潛在的緩釋或靶向特性，廣受研發(fā)人員的青睞，全球范圍內(nèi)已有 10 余種注射用脂質體產(chǎn)品獲批上市。

納米藥物與其他藥物一樣，必須具有安全性、可控性與有效性，有效性是納米藥物實現(xiàn)疾病治療的基礎。脂質納米注射劑經(jīng)給藥在體內(nèi)運轉時，需要克服多重生理/病理屏障，才能安全到達靶點發(fā)揮治療作用，在發(fā)揮其藥效前需要克服血液、組織、細胞和細胞器等多重屏障。^[1]通過調控納米藥物本身的物理化學性質，如納米藥物的大小、形狀、表面電荷等，一定程度上能夠克服藥物遞送障礙。^[2]

相比于傳統(tǒng)注射劑，脂質體具有靶向作用，可減輕藥物的毒副作用，機體器官對不同粒徑微粒的阻留能力不同，可通過脂質體注射劑的粒徑控制實現(xiàn)藥物被動靶向效果。^[3]脂質體粒徑小于50nm時一般都能夠靶向至脾組織；在50~100nm時能靶向至肝組織；在0.1~0.2μm時能夠靶向至肝組織肝巨噬細胞的溶酶體；在7~12μm時可被肺組織細胞攝取；＞12μm時能夠被毛細血管上皮細胞攝取進而到達荷瘤組織內(nèi)；＞15μm時能被腸系膜動脈等血管上皮細胞攝取^[4]。

脂質體的粒徑直接影響藥物的釋放、生物利用度、載藥量、靶向性等，在制備時應控制粒子的大小，獲得較窄且均勻的粒度分布。

脂質體制備流程概述

在脂質體的制備方法中有多種制備方法，傳統(tǒng)的方法如：薄膜水化法、溶劑注入法、逆向蒸發(fā)法等。這些方法幾乎都是先將脂質溶解在有機溶劑中，然后再去除有機溶劑。另外，也有大量的非傳統(tǒng)制備方法用于研究，如超臨界流體(supercritical fluid, SCF)、微流體技術、冷凍干燥法。此處，介紹一種脂質體的制備流程，見圖1，通過傳統(tǒng)方法制備粒徑比較大的粗脂質體，在除去有機溶劑后，再通過微射流均質的方式進一步降低粒徑及進行整粒；而后通過超濾進行純化，得到粒徑均一、滿足使用安全要求的脂質體。脂質體的平均粒徑和粒度分布是脂質體藥品關鍵質量特性，顯著影響其體內(nèi)行為。溶解磷脂可能需要用到毒性比較大的有機溶劑，溶劑殘留需要符合ICH相關規(guī)定，除去可能存在困難。超濾是影響粒徑和溶劑殘留的關鍵工藝，也是達到控制的最后一步工藝。^[5]

圖1 脂質體制備與表征流程圖

脂質體粒度控制

脂質體給藥系統(tǒng)屬于非均相熱力學不穩(wěn)定系統(tǒng)，脂質體在制備過程中，若粒徑大小及分布不合格，則會影響產(chǎn)品 后續(xù)質量問題。粗脂質粒需要經(jīng)過高壓均質或微射流進行整粒，而后進行超濾純化，得到粒徑均一的脂質體。高壓微 射流均質機具有大規(guī)模、連續(xù)化生產(chǎn)等特點，通過高速撞擊、剪切與空穴作用達到均質與細化的目的，現(xiàn)已有用于制 備阿糖苷、中鏈脂肪酸、茶多酚及維生素C等納米脂質體的實例。[6]

平均粒徑與Zeta電位檢測

脂質體理化性質評價通常包括粒徑大小及分布均勻程度、穩(wěn)定性及包封率等方面。粒徑大小及分布除與其包封率及穩(wěn)定性有關外，同時對載藥脂質體的治療效果有直接的影響。因物理和生理作用，機體能夠選擇性地在肝、脾、肺、淋巴等部位聚集不同大小的載藥脂質體，從而使其釋放藥物發(fā)揮藥效。^[7]此外，還可以通過檢測Zeta電位對脂質體穩(wěn)定性進行評價，Zeta電位越高，體系更加穩(wěn)定。

NICOMP3000系列用于脂質體粒徑檢測案例

采用GMV(giant multilamellar vesicle)：Sugar-doped lipidfilm hydration（脂膜水化反法）方式制備脂質體，對過濾 擠出工藝前后樣本脂質體用Nicomp 3000設備進行粒度檢 測，測試結果如表1所示。

表1 GMV法制備脂質體過濾前后粒徑分布圖（Gaussian 分布）

由表1可知，沒有過濾擠出前Gaussian分布下平均體積徑為1237nm；經(jīng)過0.4μm、0.2μm、0.1μm過濾器過濾擠出3次后，平均體積徑為219nm、161nm、101nm；平均粒徑明顯降低。其Nicomp 分布如表2所示。通過Nicomp分布可真實反映脂質體粒徑分布情況，由表2中可知，未擠出脂質體體積粒徑Nicomp分布有三個峰；經(jīng)過0.4μm過濾器擠出后三個峰的粒徑均減小，經(jīng)過0.2μm過濾器過濾之后變?yōu)閱畏澹?jīng)過0.1μm過濾器過濾之后獲得分布更加窄的單峰。

Before Extrusion	After Extrusion through 0.4μm Filter (3 times)
After Extrusion through 0.2μm Filter (3 times)	After Extrusion through 0.1μm Filter (3 times)

表2 GMV法制備脂質體過濾前后粒徑分布圖（Nicomp 分布）

對比Gaussian及Nicomp分布結果可知：Gaussian分布可整體反應脂質體粒徑分布情況；而Nicomp分布更真實反映脂質體粒徑分布。通過Nicomp數(shù)據(jù)的分析可以更好的幫助脂質體制備工藝的優(yōu)化，選擇合適的處理方式得到想要的粒徑范圍樣本。

尾端大顆粒和小粒子的檢測

用作載藥功能的脂質體平均粒徑一般為亞微米級別或納米級別，但仍存在微米級別的脂質體粒子，尾端大顆粒的存在往往會吸附小顆粒，影響脂質體的穩(wěn)定性，分析尾端大粒子濃度和數(shù)量可以評價當前配方和工藝的情況并做出相應優(yōu)化，例如用作佐劑的脂質體一般檢測0.8μm~10μm之間的大顆粒分布，以確保工藝的穩(wěn)定。為確保納米藥物的有效性，還需控制小粒子的濃度，過小的脂質體粒子容易被腎臟清除到尿液排出，無法起到治療作用。^[8]

AccuSizer系列用于脂質體粒徑檢測案例  

采用GMV(giant multilamellar vesicle)：Sugar-doped lipid-film hydration（脂膜水化反法）方式制備脂質體，對過濾擠出 工藝前后樣本脂質體用AccuSizer A7000設備進行粒度檢測，測試結果如表3所示。

表3 GMV法制備脂質體過濾擠出后粒徑分布圖

由表3可知，上面藍色譜圖為數(shù)量粒徑分布結果，下面紅色譜圖為體積粒徑分布測試結果。分別對制備的脂質體樣品用 10μm、5μm、3μm過濾器過濾，經(jīng)過10μm、5μm、3μm過濾器的數(shù)量粒徑分布比未過濾前濃度更低，但數(shù)量粒徑分布 差異不大；觀察體積粒徑分布，可知：經(jīng)過10μm、5μm過濾器過濾后，體積占比中大于等于10μm顆粒明顯減少；經(jīng)過 3μm過濾器過濾后，10μm顆粒體積占比進一步減少，且主峰已不在10μm處，尾端大顆粒明顯減少。

穩(wěn)定性分析檢測  

穩(wěn)定性是評估藥物的常規(guī)項，脂質體穩(wěn)定性影響存放時間和有效期，穩(wěn)定性較差的脂質體會導致藥物療效降低或副作用增加，有的藥物甚至產(chǎn)生有毒物質。控制尾端大粒子數(shù)量和濃度能有效提高脂質體的穩(wěn)定性，此外，粒徑分布較窄的脂質體穩(wěn)定性也較好。

過濾

粗脂質體經(jīng)高壓微射流等設備整粒之后，需經(jīng)過超濾才能得到最終的脂質體成品。超濾是以壓力為推動力的膜分離技術之一，優(yōu)點是沒有相轉移，無需添加任何強烈化學物質，可以在低溫下操作，過濾速率較快，便于做無菌處理等。超濾技術的關鍵是濾膜，濾膜有各種不同的類型和規(guī)格，綜合考量物理攔截，吸附攔截等效果，選擇適配的濾膜材質用于過濾。

參考資料：  

[1] 張燦.聚焦納米治療藥物的成藥性[J].藥學進展,2018,42(11):801-803

[2] 王宇馨. 磷酸錳礦化納米藥物及其抑癌作用研究[D].浙江理工大學,2022.

[3] 高諧,丁楊,周建平.脂質納米注射劑的研究與應用前景[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2019,50(10):1098-1112.

[4] 王富喜,鄧宏圖,王濱.靶向脂質體的藥理學評價[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2023,39(01):137-140.

[5] 脂質體關鍵工藝之擠出和超濾

[6] 陳瓊玲,劉紅芝,劉麗,王強.高壓微射流法制備白藜蘆醇納米脂質體[J].核農(nóng)學報,2015,29(05):916-924.

[7] 王富喜,鄧宏圖,王濱.靶向脂質體的藥理學評價[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2023,39(01):137-140.

[8] Fukumura D, Kloepper J, Amoozgar Z, et al. Enhancing cancer immunotherapy using antiangiogenics: opportunities and  challenges[J]. Nature Reviews Clinical Oncology, 2018, 15(5):325-340